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陣發性睡眠性血紅蛋白尿症研究進展

陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)是一種後天獲得性溶血性疾病。由於該病患者造血幹細胞PIG-A基因突變,引起糖肌醇磷脂(Glycosylphosphatidylinositol, GPI)錨合成障礙,從而導致經錨而連接在細胞表面的膜蛋白的缺失,導致細胞性能發生變化。血管內溶血、潛在的造血功能衰竭和血栓形成傾向是其三個主要的臨床表現。血管內溶血導致遊離血紅蛋白的釋放,可祛除循環中的一氧化氮(NO),從而引起許多癥狀,包括乏力、勃起障礙、食道痙攣和血栓等。異基因造血幹細胞移植可取的根治,最近獲美國FDA批准的補體抑製劑eculizumab 可減輕溶血、減少紅細胞輸注的需求、減少血栓的風險,因此可提高PNH患者的生活質量。北京協和醫院血液內科韓冰

 

歷史回顧

自19世紀後半葉以來,陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)逐漸引起了歐洲的內科醫生的注意,1882年,德國醫生Paul Strübing 首先觀察到PNH的紅細胞在睡眠時血清呈酸性環境下對補體敏感。1939年,哈佛醫學院的Thomas Hale Ham首先報道了PNH的紅細胞在酸性血清中出現補體介導的溶血的證據,並且使酸溶血實驗(即Ham Test)成為診斷本病的特異性實驗,直到90年代中期,才由流式細胞儀檢測對該病的診斷進行了補充。

倫敦Hammersmith醫院的John V. Dacie對PNH的臨床和實驗室研究也做出了重大的貢獻,發現PNH與再生障礙性貧血有密切關係,並由此提出PNH是在骨髓增生低下的背景下發生體細胞突變的結果,而且突變的細胞可能具有不明原因的增殖優勢。他的這些論點直到今天依然對PNH的研究有重要的影響。

上個世紀80年代,人們認識到細胞表面存在一種糖肌醇磷脂(GPI)構成的錨,可以將蛋白連接在細胞表面。1989年,人們發現了錨連蛋白中的補體調節蛋白(CD55、CD59等)在PNH的細胞表面缺失,從而對補體敏感。1993年,日本學者Kinoshita T等第一次證實PNH細胞表面GPI錨的缺失是由於發生了PIGA基因突變。

發病機制的研究進展

PNH的異常克隆為何擴增成為優勢克隆而導致疾病?PNH患者病態血細胞與正常血細胞同時存在,其各系血細胞皆有膜蛋白缺失。目前認為,PIG-A基因突變和骨髓正常造血細胞增殖機能衰減是PNH發病的兩個重要因素,但是如何形成異常造血細胞與正常造血細胞生成和增殖的不均衡狀態,異常細胞如何在數量上取得優勢的機制依然不清。截至目前,主要有3個假說:A.PNH細胞由於缺乏表面的GPI錨連蛋白,因此逃避了免疫攻擊。B.PIGA突變使得細胞獲得內在的對凋亡的抵抗,尤其是當骨髓受到免疫攻擊的時候。C.PNH克隆發生了第二次突變而產生了內在的生存優勢。這些假說並非互相排斥,因為已有數據分別支持這3種假說。

近年的一種觀點是PIG-A基因突變在正常人和不少情況下都可發生,但只有當正常造血功能衰竭時,才有可能發展為疾病,這就是PNH發病的雙重打擊學說。提出正常造血細胞表面具有一些GPI連接旦白,可以成為能刺激細胞殺傷性細胞(如T淋巴細胞)的抗原或共刺激因子,從而被殺傷,而有PIG-A基因突變的細胞由於缺失GPI連接旦白,因而可以逃避捕殺。 Karadimitris等分析T細胞的所有組成成分可以發現異常,自身反應性T細胞的靶向中有GPI連接旦白。王毓洲等[8]的工作也發現: PNH患者外周血中T8細胞/T4細胞比例增高,帶有HLA-DR標誌的活化的CD8淋巴細胞增多;γ干擾素和IL-2對CD34+CD59+的正常造血干/祖細胞有抑制作用。

人們早就發現,在一些健康人也能檢測到PIG-A基因突變。這些在正常人中發生的突變為何沒有導致PNH的發生?2006年,Brodsky等研究發現,正常人的PIG-A基因突變是發生在較晚期的造血祖細胞上的,而PNH患者的突變是發生在多能造血幹細胞水平。 PNH患者的PIGA突變來源於多能造血幹細胞(HSC),PIGA突變的HSC的擴增和分化導致臨床疾病。而在大多數正常人,PIGA突變來源於集落形成細胞(CFC),CFC可以分化,但無自我更新能力,因此,這些PIGA突變不導致疾病。這些研究雖然可以部分解釋PNH患者異常克隆擴增的原因,但依然無法闡明疾病發生的整個過程,是否在PNH患者中發生了第2個突變,導致患者的PNH克隆獲得增殖優勢,目前已有許多實驗室開始進行這方面的研究。

 

PNH的檢測

(一)PNH克隆篩檢適應證

1以血紅蛋白尿和/或血清遊離血紅蛋白增高為主要表現的血管內溶血

2無法解釋的溶血伴有鐵缺乏、腹痛或食道痙攣、血栓栓塞、血小板減少和/或白細胞減少。

3 Coombs試驗(-)、未見紅細胞裂片、非感染性溶血性貧血。

4 不同尋常的血栓形成:

(1)非常見部位血栓形成:肝靜脈(Budd-Chiari綜合征)、其它腹腔內靜脈(門靜脈、脾靜脈等)、海綿竇、皮膚靜脈。

(2)伴有溶血徵象的血栓形成。

(3)伴有全血細胞減少的血栓形成。

5 骨髓衰竭症:

(1)懷疑或確診的再生障礙性貧血或低增生性貧血

(2)難治性血細胞減少伴一系發育異常

(3)不明原因的血細胞減少症

(二)   需常規隨訪PNH克隆的患者

確診PNH患者,應常規監測PNH克隆變化,若病情穩定,可每年監測一次;出現任何臨床或血液學參數變化時應縮短監測間隔。

出現溶血和血栓,若可靠的實驗室檢查未證實PNH克隆存在,則無需密切監測PNH克隆。

(三)檢測方法

流式細胞術檢測外周血單核細胞和成熟粒細胞CD55和CD59:是目前診斷PNH的金標準由於紅細胞受輸血影響較大,應對粒細胞、單核細胞進行檢測;如果需要評估溶血的程度,應檢測紅細胞CD55、CD59細胞的比例,尤其是PNH II型細胞的比例,對預測溶血發作有一定提示作用。

流式細胞術檢測粒細胞和單核細胞氣單胞菌溶素前體變異體(Flaer): FLAER是Alexa-488標記的無活性氣單胞菌溶素前體的變異體,它同野生型前氣單胞菌溶素相似,可特異地結合於GPI錨連蛋白,但並不形成細胞通道,不引起細胞溶血,因此不會導致細胞死亡。該標記類似於熒光素,可在一定條件下被激發出熒光,可以通過流式細胞儀進行檢測,並區分GPI-和GPI+細胞。FLAER作用於所有GPI蛋白,不會因細胞表達GPI蛋白種類和多少的不同造成誤差。因此用熒游標記氣單胞菌溶素前體的變異體,是診斷PNH更敏感、特異的方法。同傳統的檢測CD55、CD59相比,FLAER對檢測微小PNH克隆非常敏感,且不受輸血和溶血的影響,對一些臨床上高度懷疑,而CD55、CD59檢測不能確診的病例,可以結合Flaer檢查,獲得明確診斷;應用Flaer分析方法診斷並監測PNH患者,可精確分出Ⅱ、Ⅲ型細胞,為判斷病情輕重提供依據,有助於PNH患者疾病進展和療效的判斷;對於長期應用免疫抑制治療的血細胞減少患者,尤其是AA、MDS等疾病,可監測其是否發生克隆性改變以及早發現病情變化。

  用於檢測白細胞PNH克隆的抗體組合

                                        Colors

         

Cells

1

2

3

4

5

6

3color

Grans

FLAER

CD24

CD15

 

 

 

3color

Monos

FLAER

CD14

CD33

 

 

 

4color

Grans

FLAER

CD24

CD15

CD45

 

 

4color

Monos

FLAER

CD14

CD33

CD45

 

 

4color

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD33

 

 

5color

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15/33

CD45

 

5color

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15

CD33

 

6color

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15

CD33

CD45

備註:  上表中加深字體的分子標誌用於檢測GPI錨鏈蛋白缺乏的細胞,未加深字體的分子標誌用於設門。具體熒光選擇可以不同,不同試劑熒光顏色也可以不同。4色、5色、6色的檢測方式敏感性高,效果良好,如(FLAER/CD24 /CD15/CD45)。 如對單核及粒細胞進行5色分析,則需要準備2個試管。舉例:以CD45,CD15,SSC標記通常可區分粒細胞與單核細胞,但若更好的分選單核細胞則需要準備另一根試管進行CD33設門。

 

(四) 國際工作組PNH臨床分類

國際PNH工作組(I-PIG)將PNH患者分為如下幾類:(1)經典型PNH:該類患者有典型的溶血和血栓形成;(2)合併其它骨髓衰竭性疾病:如再生障礙性貧血(AA)或骨髓增生異常綜合征(MDS);(3)亞臨床型PNH:患者有微量PNH克隆,但沒有溶血和血栓的實驗室和臨床證據。(見表)

分類

血管內溶血的速率

骨髓

流式細胞術

經典型

LDH顯著增高伴陣發性的血紅蛋白尿

骨髓增生活躍伴紅系造血旺盛或出現輕微形態異常

GPI-中性粒細胞》50%

合併其它骨髓衰竭性疾病

輕度(常伴溶血的生化指標的微量異常)

同時伴有骨髓衰竭證據(再障或低危MDS)

GPI-中性粒細胞<10%

亞臨床型

沒有血管內溶血的臨床或生化指標的異常

同時伴有骨髓衰竭的證據(再障或低危MDS)

使用高敏感的流式細胞檢測手段可見<1%的GPI-中性粒細胞

 

2 PNH患者血栓形成的新進展

雖然血栓栓塞不是PNH的最常見臨床表現 ,但它是導致死亡的主要原因,尤其是美國和歐洲的患者。肝靜脈血栓、肺栓塞、腸系膜靜脈血栓和靜脈中風與血栓相關死亡率顯著相關。肝靜脈血栓導致的Budd-Chiari 綜合症是PNH最常見的血栓併發症,是死亡的主要原因。腦靜脈和靜脈竇血栓是第二位最常見的血栓。在我國,雖沒有歐美國家常見,也是導致患者生活質量下降甚至死亡的常見原因。因此,PNH被認為是易栓性疾病之一。

最近的臨床研究支持血栓事件的發生與PNH克隆的大小直接相關的假說。 Hall[12] 等人證實10年內發生血栓的風險在中性粒細胞GPI錨連蛋白(GPI-AP)陰性比例>50%的患者是44%, 而中性粒細胞GPI-AP–比例<50%的患者為5.8%。 Moyo[13]等人應用邏輯回歸分析模型,計算出每增加10% 比例的GPI-AP–中性粒細胞,血栓的優勢比為1.64。 按照該研究,具有>70%的GPI-AP–的中性粒細胞發生血栓的風險比只有20% GPI-AP–中性粒細胞者大11.8倍。

PNH患者血栓前物質和纖溶活性的增加,導致纖維蛋白產生和倍增的增加。除了溶血本身,人們也注意到一些纖溶系統功能喪失,包括PNH表型白細胞的尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑受體的缺失和血漿可溶性尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑受體的增加。在PNH,血小板的刺激伴隨著膜磷脂不對稱性的缺失,導致絲氨酸磷脂外露和微泡的形成,已在體外試驗中被證實。膜來源的微粒體證實可提供凝血前體酶複合物、凝血酶原酶及Tenase複合體(因子Ⅸa、Ⅷa、Ca及磷脂)裝配所必需的催化表面。在血流中,高水平的從溶解的紅細胞、凋亡細胞或激活的血小板來源的前凝血質微粒體的出現,可解釋血栓前狀態的播散[14]

雖然PNH的血栓出血機制還在推測階段,本病基本的臨床表現--慢性的血管內溶血可能是潛在的最重要的原因。嚴重的血管內溶血事件,表現為乳酸脫氫酶(LDH)的升高和血紅蛋白尿,經常與血栓事件以及吞咽困難、腹痛、勃起障礙和嚴重的乏力相關。這些癥狀與細胞遊離血漿血紅蛋白和一氧化氮(NO)清除所致的平滑肌障礙是一致的。在溶血過程中,血漿和尿中的血紅蛋白和亞鐵血紅素的水平增加(血紅蛋白血症和血紅蛋白尿症),遊離血漿血紅蛋白清除NO,它與NO有高親和力,並去除它,而亞鐵血紅蛋白具有許多促炎症和促氧化特性。此外,溶血也釋放紅細胞精氨酸酶,---一種轉換L-精氨酸的酶,將L-精氨酸(NO合成的底物)變成鳥氨酸;因此,進一步降低了NO。 NO是平滑肌緊張度的調節劑,血小板的激活和血漿NO水平的降低導致平滑肌張力鬆弛,包括胃腸道的收縮、高血壓、勃起障礙和血栓形成。此外,NO還通過下調血小板的聚集和粘附來維持正常的血小板功能。PNH血小板表面缺乏補體調節蛋白CD55 和 CD59,使這些細胞對補體介導的激活敏感,再加上NO的缺乏,導致PNH的血栓傾向。 因此,PNH是血管內溶血伴有所有的NO減少的臨床後果的疾病原型,包括血栓出血[15]

PNH治療的進展

 

Eculizumab 治療 PNH

Eculizumab 是人源化的單克隆抗體,與人C5補體蛋白特異性結合,阻止其裂解為C5a 和 C5b,從而不能形成膜攻擊複合物。Eculizumab是 IgG kappa免疫球蛋白,其Fc段是 IgG2和IgG4的雜合體,沒有下游活性,因此,Eculizumab只是阻斷C5的裂解和活化。Eculizumab 一直與靶位點結合,直到從循環中清除。

2002年5月,在英國2所研究所中,開始了Eculizumab的初始臨床研究。11例有溶血的輸血依賴(入選之前12周有超過4次以上輸血)的PNH患者,接受為期3個月的治療。患者很快改善了生活質量、血尿停止、脫離了輸血依賴。2006年,多中心,雙盲、隨機、安慰劑對照的TRIUMPH試驗顯示了對經典型PNH的療效:該試驗入組嚴格, 87例隨機分為安慰劑組 (N = 44) 或 eculizumab (N = 43), 600 mg/w 4周,隨後900 mg 1周, 然後每2周900 mg 共6個月。治療組血紅蛋白穩定,輸血次數為0,生活質量提高,LDH下降。主要副作用:頭痛、鼻咽炎、背痛和上呼吸道感染(治療前接受腦膜炎疫苗)。2006年,更廣泛的、開放適應症的、非安慰劑對照的III期SHEPHERD試驗: eculizumab劑量同前,應用52周,貧血減輕、輸血減少、生活質量提高、副作用同前,進一步驗證了其安全性和有效性。總共195 例參加上述3個試驗的患者,其中187例完成了上述試驗並參加了為期2年的3b期開放標籤的擴展研究(2007):感染髮生率並未增加。 先驅研究及其引出的隨後的2個研究: TRIUMPH 和 SHEPHERD研究,最終使Eculizumab在2007年獲得了美國FDA和歐洲藥物協會(EMEA)的批准[19-21]

Eculizumab除了很好地控制了PNH的溶血外,對PNH 的其他併發症也有一定作用:血栓:上述3個臨床試驗中也觀察了血栓併發症的情況, 對治療前後血栓發生的數目和部位都進行了詳細的記錄。在總共195個患者中,Eculizumab治療前共有血栓事件124例次,平均7.37次/100患者/年,而治療後僅1.07/100患者/年,因此Eculizumab治療顯著地降低了血栓的發生率(P < .0001)。進一步的研究顯示,即使在有抗凝治療(肝素、華法令)情況下,PNH血栓的發生率依然很高,而加上Eculizumab後,血栓事件幾乎沒有。因此,在常規抗凝治療不能防止進一步血栓形成時,Eculizumab可以很好地控制血栓的發生。腎功能衰竭:從Eculizumab研究的早期數據看,補體抑制可減輕腎功能的破壞,因此可以改善腎功能。 一氧化氮的消耗:PNH的許多癥狀,可能都與血漿中遊離血紅蛋白消耗一氧化氮(NO)有關。除了與NO消耗相關的癥狀,血管內溶血的後果還包括肺動脈高壓。Eculizumab可以抑制地減輕血管內溶血,可以大大改善NO消耗相關的癥狀[19-21]

但是,Eculizumab必須保持在35 µg/mL 以上以維持對 補體的阻斷。少部分PNH患者的藥物谷濃度低於35 µg/mL,而且血管內溶血可再次發生。對大多數患者來說這種對補體抑制的突破可以通過稍微提高Eculizumab的劑量到900mg/12天或1200mg/2周來避免; 此外,PNH細胞表面同樣缺乏另一種補體調節分子衰變加速因子(DAF或CD55),它可防止C3裂解和C3b產生。Eculizumab的阻斷作用是在C3以後水平的,C3在用藥後產生會增加,因為DAF的缺乏,可導致細胞表面C3b的堆積。由於PNH紅細胞上富有C3b和C3d,因此更迅速地被網狀內皮系統清除,而引起血管外溶血。儘管Eculizumab可以解決血管內溶血,但血紅蛋白並未恢復到正常水平;大多數PNH患者接受Eculizumab治療會停止輸血,這樣會導致PNH紅細胞的比例增加,一旦停止Eculizumab,可能會出現血紅蛋白的突然下降Eculizumab和嚴重的血紅蛋白尿。 因此,如果不得不停止使用Eculizumab,應密切觀察病人,一旦出現癥狀,考慮輸注紅細胞。不用說,應教育病人不應簡單停止哪怕一次約定的治療;補體活化瀑布可以在C5水平終止而去除了末端補體活性,引起的副作用最主要的問題是莢膜菌的感染,尤其是奈瑟氏菌感染(腦膜炎球菌或淋球菌)。少部分患者,雖曾經接受腦膜炎疫苗接種,還是發生了腦膜炎球菌的感染(到目前為止都是敗血症而非腦膜炎),發生率為0.5例/100接受治療患者。降低腦膜炎球菌感染的2個措施包括接種疫苗和早期治療[19-21]

綜上所述,目前應用Eculizumab的指征為:具有中度或重度PNH癥狀(如顯著的乏力和生活質量很差);已經發生或正在發生PNH的合併症,如血栓或腎功能不全的患者。AA/PNH 可能反應不佳,因為骨髓抑制,而非補體介導的溶血是貧血的主要原因。此外,該葯價格昂貴,目前尚未進入我國。

由於C5單抗的使用, PNH患者的生存率數據已經和正常人群比較無顯著差異。去年英國研究者對BMT指征的PNH患者比較了BMT和C5單抗兩種治療方法的生存率,結果發現,在合併AA的患者中,C5單抗治療效果優於BMT,在有合併血栓的患者中,兩者也基本一致。因此目前國外並不推崇PNH患者進行骨髓移植,用C5單抗就能獲得較好的生存和生活質量。C5單抗在妊娠患者中應廣泛應用,有11例患者安全懷孕和生產。對需要治療的患者,C5單抗的治療從PNH患者開始懷孕到產後3個月內都要使用。 

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